全球热门:生物制品表征之蛋白质N端序列分析

随着现代医药工业的发展，蛋白质药物变得备受关注，而蛋白质药物的N端序列分析对于医药工业来说是非常重要的信息。N-端序列与蛋白质的功能和稳定性息息相关，对蛋白质进行N-端测序分析，可以确定蛋白质的起点，有利于帮助分析蛋白质的高级结构，揭示蛋白质的生物学功能。

百泰派克生物科技BTP为您提供多种蛋白质N端序列分析技术服务，基于Edman降解法的蛋白质N端序列检测、基于高分辨质谱法的蛋白质N端序列检测，详见如下介绍：

一、基于Edman降解法的蛋白质N端序列分析

(相关资料图)

1. 原理:

Edman测序反应是一个循环过程，即在弱碱性条件下使多肽/蛋白与异硫氰酸苯酯（PITC）反应，然后用酸处理，从多肽链上仅使氨基末端残基以氨基酸的苯基乙内酰硫脲衍生物的形态游离出来，然后对分离出的氨基酸进行鉴定。

2. 实验仪器：

全自动蛋白质/多肽测序仪（PPSQ33A）

3. 应用：

Edman降解法测定蛋白质N端序列，通过跑胶转模或者点膜的方式进行样品处理，可以直接分析氨基酸信息，不需要任何蛋白质数据库就可以准确分析N端氨基酸序列，特别是能辨别异亮氨酸和亮氨酸、谷氨酰胺和赖氨酸。但是Edman降解法的通量低，而且不适用于N端已被化学修饰或封闭的蛋白或者多肽不可用。

4. 结果展示：

为对19种PTH-氨基酸进行校准，故先测试19种PTH氨基酸的混合标准品，校准测试混合标准品图谱如下：

标准品校准测试图谱

PTH氨基酸混合标准品校准测试完成后，测试样品的N-端序列，样品测试图谱如下：

N端第1位

N端第2位

N端第3位

通过上述图谱可以确定蛋白质N端序列为Tyr-Val-Trp。

二、基于高分辨质谱法的蛋白质N端序列检测

1. 原理:

20世纪80年代末发展的电喷雾电离（ESI）使质谱技术在蛋白质结构分析上的应用发生了革命性飞跃。对于基于高分辨质谱法的N端测序，样品经过SDS-PAGE分离目标蛋白后使用蛋白酶酶解，酶解后产的产物用Q-Exactive系列质谱仪（Thermo Fisher Scientific）进行质谱分析，肽段在质谱中碎裂得到b、y离子的二级质谱图，通过图谱与蛋白理论氨基酸序列比对确定蛋白质的N端位置。

2. 实验仪器：

高效液相色谱串联质谱仪：高效液相色谱仪-Easy-nLC 1200；电喷雾-组合型离子阱Orbitrap 质谱仪-Q Exactive™ Hybrid Quadrupole-Orbitrap™ Mass Spectrometer。

3. 应用：

基于高分辨质谱法的N端测序，可以通过高分辨率质谱分析N端封闭和翻译后修饰(PTMs)，从而确定蛋白质N端起点。对于复杂的蛋白，我司支持对复杂蛋白进行N端二甲基化标记，通过分析标记位置确定复杂蛋白样品中的多个蛋白的N端起点。

4. 结果展示：

蛋白药物样品的N端氨基酸序列分析：

Trypsin酶解后的样品经过LC-MS/MS分析后得到质谱数据，质谱数据经过与理论数据库匹配，得到和理论N端序列（HYAHVDCPGHADYVK）相符合的MS2图谱，图谱如下：

N端序列二级质谱图

通过以上分析可以得出此蛋白药物的N端起始氨基酸为组氨酸，N端序列为HYAHVDCPGHADYVK。

常见问题：

问题1：Edman降解法和质谱法检测蛋白质N端的优点与缺点？

回答：

质谱法： 

优点：

1.能获取更长的N端序列信息；

2.可分析N端封闭和PTMs。

缺点：

1.等重的氨基酸不能确定；

2.肽序列的覆盖率很少是100%。

Edman降解法：

优点：

1.可以准确分析N端氨基酸序列，特别是能辨别异亮氨酸和氨酸、谷氨酰胺和赖氨酸；

2.直接分析氨基酸信息，不需要任何蛋白质数据库，可以识别未登记在数据库中的未知蛋白质。

缺点：

1. N端已被化学修饰或封闭的肽不可用；

2. 低通量分析。

问题2：N端发生修饰的蛋白如何确定其N端位置？

回答：

在数据分析时同时分析N端的PTMs，分析鉴定出有修饰的N端位置。

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